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最新综述污水流行病学(WBE)用于新冠肺炎COVID-19预

更新时间:2020-07-18 15:36点击:

  北京建筑大学郝晓地教授研究团队对最新的污水流行病学(WBE)用于应对COVID-19疫情的研究进行了综述,尽管目前相关研究还十分有限,但已足够有效证明WBE在SASR-CoV-2出现、传播以及监测方面的作用和价值。传统“点对点”式RNA或其抗体检测固有弊端也促使学者、管理者对现有疫情防控体系重新思考;同时,对具有“点对面”性质的WBE方案逐渐重视。基于目前WBE在SARS-CoV-2监测方面的研究结果,美国CDC已经开始考虑和企业、污水公司等开展WBE项目合作,用于指导疫情防控或者为可能再次爆发病毒提供预警信息。尽管我国COVID-19疫情已经得到了稳定控制,但疫情扩散、反弹风险依然存在。随着我国对水环境保护的重视和城市管网不断优化,城市污水收集覆盖率已达95%,这就为我国应用WBE作为病毒出现和传播预警机制提供了研究基础。当下我国排水系统管理正向智能化方向发展,这也为WBE研究和应用提供了可能和契机。

  突发天灾新冠病毒肺炎(COVID-19)疫情已蔓延至全球几乎所有国家,累计确诊病例已近350万例。这一全球大流行病尽管现阶段在我国已得到基本控制,但因不容乐观的全球疫情扩散以及SARS-CoV-2病毒无症状感染者出现,依然存在疫情反弹的巨大风险。在病毒疫苗正式投入临床应用之前,COVID-19爆发有效预警机制依然是最需要的技术手段。鉴于感染者粪便/尿液中存在病毒粒子或遗传物质核糖核酸(RNA),荷兰学者提出了基于污水流行病学(WBE)监控SARS-CoV-2出现并传播的设想。目前,污水中SARS-CoV-2病毒有限RNA检测研究已经证明了这一技术作为疫情预警的可行性,亦可能根据WBE检测结果表征病毒传播动态与趋势、估算感染群体比例,甚至在一定范围内进行感染群体追踪。在总结WBE技术在我国发展应用基础上,对已有污水中SARS-CoV-2核酸(RNA)检测研究结果、应用价值和指导意义进行综合分析,总结WBE研究标准化方案,辨析急需深入研究的方向领域。这对我国下一阶段疫情防控具有相当的启发与参考价值。

  新冠病毒肺炎(COVID-19)已被世界卫生组织(WHO)界定义为全球大流行病。截至2020年4月底,全球被感染人数已累计超过300多万例,且确诊人数增加趋势在国外继续。反观我国抗疫情况,自2019年12月出现首例COVID-19感染者,到爆发并扩散至全国(累计确诊8万多例),我们依靠制度优势迅速调集全国军队、地方医疗力量,经过2个多月的拼死努力已基本控制住全国疫情,取得抗疫阶段性胜利。目前,国内正采取复工、复产行动,疫情防控已开始进入常态化管理。由于境外疫情扩散目前仍然未能见顶,且病毒疫苗尚未进入临床应用,所以,我国外防输入、内防反弹的压力依然很大。核酸(RNA)与抗体联合检测、相互配合可以有效甄别新冠病毒(SARS-CoV-2)感染者以及无症状感染者,从而化解病毒再次传播的风险。但是,核酸和抗体检测作为典型“干预式”、“点对点”筛查手段,不仅耗时费力,还会因被检测个体所处不同感染阶段而导致错检或漏检,并不具有提前研判疫情的能力。这就导致对病毒传播预警机制的热切期盼。目前,越来越多证据表明,肠道系统组织细胞很可能也易遭SARS-CoV-2侵入;而腹泻等肠道系统不适也已被认定为COVID-19的典型症状之一。这就是在病毒感染者粪便/尿液中已多次检出SARS-CoV-2遗传物质(RNA)存在的原因;病毒因此有可能通过排水管道系统进入水环境,继而引发人们对粪口传播病毒之担忧。除个别研究在病毒感染者粪便/尿液中通过培养检出了具有活性的病毒外,其他研究并没有对所采集的粪便、尿液进行病毒活性培养检验。但是,至今仍没有病毒粪口传播发生的报告,因此,SARS-CoV-2病毒通过污水传播可能性较小。从污水中检测到病毒或其遗传物质RNA也为病毒传播预警或疫情爆发判断提供了一种新的思路:可以通过检测SARS-CoV-2遗传物质RNA在污水中是否存在来研判COVID-19感染者存在与数量多寡,可以基于污水流行病学(Wastewater-basedEpidemiology,WBE)或环境检测(EnvironmentalSurveillance,ES)疾病建立可行的病毒预警机制。实际上,WBE早已被用于监控水传播疾病在人群中的传播情况,在日本和以色列已体现出其在预警脊髓灰质炎病毒方面的价值。目前,虽然有限但很有价值的相关研究已证明WBE技术在预测SARS-CoV-2病毒传播方面的可行性,甚至这项技术可以早于医学临床检测并预警病毒存在并扩散的风险。WBE作为一种“非干预式”、“点对面”之检测手段,能够弥补核酸或抗体检测的弊端,为预警疫情再次爆发及时提供信息。国内虽已有在粪便和污水中检测到SARS-CoV-2病毒的较早报道,但尚无基于WBE的类似研究,所以,我们试图综述、总结目前已公开发表的与COVID-19病相关之WBE研究进展。首先,介绍WBE技术原理及在我国的应用情况;其次,分类讨论现有SARS-CoV-2病毒检测WBE研究成果,同时分析其应用价值与指导意义;最后,对可用于WBE研究的标准化方法与亟待深入研究的方向进行把脉。这对我国下一阶段疫情防控具有相当启发与参考价值01污水流行病学(WBE)

  污水流行病学(WBE)是通过量化分析污水中目标化学或生物标记物来定性或定量推演污水收集区域居民活动与健康情况的一种调查监控方法,其过程方法如图1所示。这一思路首先由美国环保署(USEPA)研究员在2001年提出,随后在一些国家获得应用。2005年,意大利研究人员对4座污水处理厂进水中的可卡因代谢物含量进行了检测,揭示了该区域人群可卡因使用趋势,证明这种方法的可操作性。从此,WBE方法逐渐获得研究者与管理者的青睐;被检测的标记物种类也越来越为广泛,包括非法药物、处方药、代谢物、PPCPs、抗生素等。2010年,欧洲毒品和毒瘾检测中心(EMCDDA)成立了SCORE(SewageanalysisCORegroup-Europe)小组,旨在通过标准化污水取样、保存和检测等方法在欧洲建立非法药品使用WBE监测网络。2017年,澳大利亚刑事情报委员会(ACIC)实施了“国家基于污水药品使用监测”(NWDM)计划,用于监测甲基苯丙胺使用情况,可以覆盖54%澳大利亚人口。

  水传播病毒占污水中微生物群体较多成分,而且也是人类很多疾病主要传染、扩散方式。为此,国外一些研究人员提出将WBE用于水传播疾病的检控,例如,对脊髓灰质炎病毒、肝炎病毒和诺如病毒等的检测,并已在日本和以色列获得实际应用。此外,在污水中也常会检测到一些动物传染病毒,例如,禽流感和SARS病毒,它们完全符合应用于WBE研究的原理,这也是目前一些学者提出应用WBE预警SARS-CoV-2病毒的理论基础。

  图1显示,WBE基本工作原理可分为三个阶段:标记物释放、标记物输送与标记物回收检测。通过在污水收集干管泵站或污水处理厂进水口采样检测选定标记物,可定性对某种化学物或病源体在人群中的使用或存在情况进行分析判断。对COVID-19疫情来说,标记物便是SARS-CoV-2病毒遗传物质RNA。因病毒不能在寄主细胞外进行复制,所以可基于三阶段效率参数,由函数(式1)反推估算病毒在人群中的传播情况、感染者数量或在人群中的占比。显然,标记物释放量确定、标记物在管道中输送动态变化以及标记物取样和检测方法(PCR)都可能给函数(式1)计算带来不确定性,这也就成为新冠病毒WBE研究的主攻方向。有关WBE技术优缺点、具体实施流程等详细信息可参考已有文献。

  其中,N—关联对象人数/标记物所占比例;M——标记物浓度;Q——取样处污水总量;η——标记物在管道中输送效率;q——对象个体污水产生量;m——对象个体标记物产生量;P——区域人口总量。

  WBE技术取决于污水收集系统等基础设施的发展与完善,所以,它在我国的研究、应用起步较晚。2013年,济南市疾病预防控制中心报道了在山东某地完成的一起疫苗衍生脊髓灰质炎病毒流行病学调查与处置情况,成为国内首先应用WBE技术指导疾病防控的不多案例。到目前为止,文献检索可获得有关“污水流行病学”为主题的中文论文共30篇,其关键词共现网络如图2所示。显然,我国有关WBE研究主要集中于对毒品滥用的检测分析,其他标记物包括城市烟草以及诺如病毒等。研究人员在辽宁和吉林15个城市选取17座市政污水处理厂,对甲基苯丙胺用量进行了WBE研究分析;对甲基苯丙胺在该地区用量进行反推估算获得了有价值的WBE定量分析结果。然而,我国目前其他WBE研究取样范围大多局限于一两座污水处理厂,而且有关图1所示三阶段效率的研究基本空白,同时也没有标准化WBE应用方案,整体上仍处于方法验证水平。

  2020年3月24日,荷兰国家水研究中心(KWR)首次报道了污水中检测到SARS-CoV-2遗传物质RNA研究成果。研究人员在荷兰6个城市与阿姆斯特丹史基辅机场附近展开3批次污水采样监测(2月5日至3月16日),其研究时间比荷兰临床确诊COVID-19首例病例(2月27日)还早3周时间。检测结果显示,在2月6日所取污水样中,SARS-CoV-2病毒RNA结果检测均为阴性;但在3月5日大部分污水样中(5/8)RNA检测结果已呈阳性;至3月15日,几乎在所有污水样品中均检测到了SARS-CoV-2病毒RNA(9/10)。这一初步研究结果无疑为COVID-19疫情防控提供了一种“非干预式”可行替代方案。在此之后,不同国家研究人员陆续开展了相关研究,均在污水中检测到了SARS-CoV-2遗传物质RNA,并试图从结果中挖掘更多有价值信息,以评价WBE在指导疫情防控中的作用和意义。表1总结了目前已公开发表的针对COVID-19的WBE研究结果,可以直观分析WBE在控制SARS-CoV-2病毒传播方面的指导作用。表1所列全部研究均遵循图1所示研究流程,标记物为SARS-CoV-2中的RNA,检测方法则为临床病毒检测广泛使用的RT-PCR法。

  最新发表的一篇研究论文提及,SARS-CoV-2虽然与2003年SARS-CoV病毒同属一个家族,但它却表现出对人体宿主细胞更好的适应性和更强的传染性,这也是COVID-19疫情影响如此广泛的原因,更引起学者对未来传染性疾病高效预警机制的思考。SARS-CoV-2目前已知而不同于以往SARS-CoV的特点包括:1)感染者初期存在无症状现象;2)无症状阶段实际已具有传染性;3)潜伏期较长、难于及早发现。这就给COVID-19疫情及时甄别、隔离、控制带来了困难和挑战。医学上的困惑或许可以借助WBE方法检测出SARS-CoV-2作为COVID-19感染的预警信号。因此,WBE研究作用和意义重大。荷兰进行污水RNA检测结果显示,3月5日在Amersfoort地区污水RNA检测结果呈阳性,但彼时该地区尚未有COVID-19临床确诊案例,这就证明WBE作为病毒预警信号的可行性。鉴于荷兰政府于3月16日方宣布实施居家隔离措施并开始对疑似病例检测RNA,所以,WEB检测结果说明该地区其实早已经存在SARS-CoV-2输入病例,只是医学还未确诊而已。同样,西班牙污水检测结果也支持WBE可作为疫情爆发预警判断的方法。在西班牙进行的污水病毒RNA检测中研究人员发现,在有临床确诊病例之前已经可以在污水中检测到SARS-CoV-2遗传物质RNA。在Lorca,Cieza和Totana等地区,污水中检测到SARS-CoV-2遗传物质RNA时间(3月16日)甚至比首例感染者(3月20~27日)临床确诊时间提前了十几天。西班牙政府于3月13号已宣布居家隔离措施,所以,污水中检测到病毒RNA应该就是源于本地确诊案例。尽管WBE作为本次疫情爆发预警信号之意义已经错失,但很多学者均表达了对疫情再次爆发或今后其他病毒来袭的担忧,甚至有模型预测指出COVID-19疫情波动可能将持续至2022年。可见,WBE用于病毒传播预警方法具有很大实用价值。

  及时准确地确定COVID-19感染者数量变化趋势与SARS-CoV-2传播流行情况能够为疫情防控措施或医疗资源布局提供信息并及时做出相应部署调整。目前,研究人员通常采用传播指数(Rt)来描述SARS-CoV-2传播动态变化情况,以研判所采取防控措施的有效性。然而,Rt准确获得仍依赖于大量RNA检测和流行病学调查。如果检测速度落后于病毒传播速度,不仅不能采取相应强度的阻断措施,还可能会导致疫情扩散恶化。因此,基于WBE方法的污水RNA检测能否有效表征疫情动态变化也是研究人员所期望的研究方向。

  在法国污水RNA检测研究中,研究人员在巴黎地区进行了4次间隔相对均匀的时序采样(3月5日至4月7日),并将RNA浓度变化与临床确诊人数进行了横向对比分析。对比结果显示,在采样时段内,污水中SARS-CoV-2的RNA含量上升趋势与污水处理厂服务区域临床确诊人数变化趋势存在良好的正相关性,如图3a所示。这就为WBE用于表征新冠病毒传播动态变化趋势提供了有力证据支撑。

  图3法国(a)和西班牙(b)污水中核酸(RNA)含量(散点)与临床确诊感染人数(折线)变化趋势比较(由文献中数据整理绘制,准确数据参考原文)

  然而,来自西班牙的RNA检测结果则似乎并不能支撑法国上述结论,如图3b所示。在同样为期1个月监测时段内,污水中检出的SARS-CoV-2核酸(RNA)含量变化并不明显,并没有反映出该地区临床确诊人数的上升趋势。综合分析来看,原因可能来自以下几个方面:1)在西班牙的检测区域范围内,整体临床确诊人数较少,而污水流量则很大,不确定的稀释比例可能会给核酸样品采集和检测准确性带来不可预估的偏移,难以反映线)西班牙的取样时段处于该地区疫情爆发的早期阶段,而粪便中检出病毒RNA存在滞后的可能,继而导致确诊病例的增加并不能通过粪便核酸含量变化体现;3)COVID-19感染者的粪便并不会100%能检出病毒核酸,假设两个地区粪便不会出现病毒的感染者数量相同,在确诊病例样本较小的情况下,也会导致污水中核酸含量变化不明显。由此可知,在感染群体较小的区域,可能存在污水检出核酸含量变化趋势不明显的情况,此时,应慎重依赖于WBE表征疫情变化趋势这一指导作用,但仍可用作预警信号(只与核酸有无相关而不考虑其含量)。此外,美国蒙大拿州RNA检测结果表明,WBE检测对于疫情缓解也具有较好的指示性表征。研究人员在蒙大拿波兹曼地区进行了为期9天的污水RNA检测,虽然取样周期较短,但取样频率很高(间隔2~3天)。结果显示,污水中病毒RNA含量呈现下降趋势,这与该地区临床确诊数病例呈逐渐下降趋势有着很好的一致性。然而,WBE这一指导作用仍需大量实验验证来证明。最近多项研究表明,COVID-19感染者在痊愈后,即使咽拭子RNA结果呈阴性,其粪便RNA检测结果仍会呈现阳性,这无疑会给WBE表征疫情下降趋势造成影响。从应用角度来看,如果通过构建合理方案确保WBE能够稳定反映病毒传播下降趋势,相比于检测病毒传播增长肯定更具实际意义。这一信息不仅能够帮助社区对所采取的防控手段进行研判,还能为解除居家隔离以及复工复产提供判断信息。

  在COVID-19爆发初期,往往存在感染人数增长迅速与医疗资源不足的矛盾,会导致大量医务人员感染或疫情持续恶化现象。造成这种状况的原因之一就是初期不能及时掌握感染者存量到底多少,从而导致不能及时对有限医疗资源进行合理调配或事先扩大医疗设施。显然,核酸“点对点”检测并不具备这样的能力。而根据上述(2.1)内容以及式(1)函数,WBE“点对面”检测或许可以在疫情爆发初期进行感染总量推演估算。这便是WBE方法备受青睐的又一指导疫情防控的意义。根据表1结果,美国和澳大利亚研究人员分别尝试了以污水RNA检测量、藉公式(1)来估算相应区域感染人数或所占群体之比例。在美国马萨诸塞州污水RNA检测估算中,研究人员作出如下假设:1)服务区人口为2.3×106人,污水总量为1.36×109L/d;2)每人每天排便一次,每次200g;3)SARS-CoV-2遗传物质RNA在管道中输送效率为100%。假如感染者平均每g粪便中病毒含量为6×105个,则根据污水中病毒含量估算的感染者占到总人口的5%;当粪便中病毒含量取值为3×107个/g时,感染者在人群中的比例则降至0.1%,但仍远远大于同期临床确诊的感染比例(0.026%)。由于该估算基于大量数据假设,结果存在很大不确定性。研究表明,感染者在出现症状后的第一周内,粪便中病毒含量约为107个/g,但到第三周时病毒含量便下降到103个/g。此外,不同感染者粪便中检出病毒RNA的持续时间也存在很大差异,部分感染者粪便RNA阳性结果持续2~5天,而个别感染者持续时间却高达30多天。这些动态变化均给公式(1)应用带来了困难和不确定性。在澳大利亚研究中,研究人员采用相同方法、依据污水中RNA含量估算了人群中感染者比例,结果约为0.096%。遗憾的是,因该地区临床确诊数据无法获得而导致无法进行横向比较。但研究人员用蒙特卡洛法检验了各项假设参数对结果不确定性的影响程度。结果表明,感染者粪便中病毒含量对估算结果影响最大,其他参数影响大小依次为污水中病毒检出数,个体每天粪便量以及人均污水产量。这也就很好地解释了美国马萨诸塞州在不同粪便病毒含量下估算结果出现的差异性。从表1数据可以看出,不同地区污水中检测到SARS-CoV-2核酸含量波动非常大,部分地区甚至相差1000倍之多。而这些检测数据还未考虑检测回收效率,即污水样品预处理、浓缩以及可能存在的抑制物质对结果带来的影响。因此,根据目前已有研究结果和信息,WBE用于估算COVID-19感染数量或比例仍有很大困难和不确定性,需要进一步系统性研究,特别是影响图1描述的核酸释放效率、管道输送效率和检测回收效率等各个因素。

  WBE研究除具有上述经常提及的指导作用外,污水中病毒RNA检测还可以为污水处理厂工作人员提供风险评价和作业指导。根据目前已有的数据,污水基本上不大可能成为COVID-19传播媒介,污水厂工作人员做好基本防护即可。另外,由于RNA的不稳定导致病毒的高变异性,如果污水病毒RNA检测配合基因测序,通过系统发生树进行病毒溯源,可以寻找防控措施可能存在的薄弱环节。例如,在美国蒙大拿州污水核RNA检测中发现,对回收病毒RNA逆转录扩增后进行测序后结果显示,核酸序列与法国报道序列高度相似,表明该地区疫情很可能从法国输入,这与美国疾控中心(CDC)近期发布的周报告显示病毒源来源于欧洲结果一致,说明前期防范输入型病例防控措施不足。此外,部分学者也提出将WBE用于感染病例追踪的设想。但从WBE的“点对面”性质可知,因为目前采取的是污水管网末端采样方式,实现病例的精准追踪似乎很困难。但是,这也给WBE研究作为预警信号提供了启示,在实际污水监测中,可以通过增加管网中取样点和控制点,以便更好地完成污水分流并缩小病毒来源追踪范围,用于判断特定区域病毒传播程度或病毒来源(例如,养殖场或屠宰场等)。这无疑对学校、写字楼等人员较为密集场所进行疫情防控提供了可选方案。但需要注意的是,扩大污水监控点可能会引发对个人隐私泄露的担忧。因此,监控点的选取应综合考虑各种因素。

  从上述WBE工作原理及在疫情防控中可能行指导作用可知,如何提高污水中SARS-CoV-2遗传物质RNA检出敏感性是发挥其预警指导作用的基础,即,图1所示的病毒检测回收效率;而对病毒释放效率和管道输送效率进一步完善研究则能够为WBE预测提供更多定量信息。如前所述,WBE用于监测病毒在人群中的传播已经得到了较为广泛的研究和部分应用,但大多限于水传播病毒,如,脊髓灰质炎病毒和肝炎病毒(非包膜病毒)。但是,SARS-CoV-2属于包膜病毒,已有RNA浓缩回收方法是否仍然适用,还需大量实验予以确定。水传播病毒浓缩回收方法及与SARS-CoV-2不同之处已有相应参考文献。2020年4月30日,美国水研究基金会(WRF)举办了一场关于WBE在线研讨会,对目前已有WBE监测SARS-CoV-2案例和研究结果进行梳理和总结,并针对污水取样、病毒RNA浓缩提取及检测方法提出了建议,以期通过方案标准化强化信息共享,充分发挥WBE在COVID-19联防联控中的作用。有关这次研讨会主要内容总结于表2,以期为相关研究提供参考。专家达成共识的建议内容较为全面,涉及污水取样点选取、保存,以及样品处理、检测、空白对照组设置等信息。而在具体实施中如何选择适当方法则取决于WBE研究的目的,即,应用于病毒传播预警、趋势变化、感染人数还是感染追踪。例如,在WBE用于病毒出现或传播预警、指示感染者数量和疫情变化趋势时,所采取的方法应更注重检测技术在病毒RNA浓度较低时的检出敏感性,而不需要RNA定量数据。相形之下,如果WBE用于确定感染者群体数量或比例,则应采取更加注重污水中RNA检测的量化数据,此时应采用流量变化的复合样品,以降低结果的不确定性。其他考虑因素可根据WBE研究目标参考表2方案建议。

  综上所述,尽管目前应用WBE应对COVID-19疫情的研究还十分有限,但已有研究结果足够有效证明WBE在SASR-CoV-2出现、传播以及监测方面的作用和价值。传统“点对点”式RNA或其抗体检测固有弊端也促使学者、管理者对现有疫情防控体系重新思考;同时,对具有“点对面”性质的WBE方案逐渐重视。基于目前WBE在SARS-CoV-2监测方面的研究结果,美国CDC已经开始考虑和企业、污水公司等开展WBE项目合作,用于指导疫情防控或者为可能再次爆发病毒提供预警信息。尽管我国COVID-19疫情已经得到了稳定控制,但对于境外疫情仍在肆虐、前景不明的现状,国家卫健委也重申了我国疫情扩散、反弹风险依然存在,防止病毒卷土重来仍将是未来很长一段时间的工作重点。随着我国对水环境保护的重视和城市管网不断优化,城市污水收集覆盖率已达95%,这就为我国应用WBE作为病毒出现和传播预警机制提供了研究基础。况且,当下我国排水系统管理正向智能化方向发展,这也为WBE研究和应用提供了可能和契机。

  郝晓地,男,1960年4月生。北京建筑大学全职讲席教授,博士生导师,主要从事污水处理教学与科研工作。2001年10月获得荷兰代尔夫特理工大学(TUDelft)博士(PhD)学位,导师为MarkvanLoosdrecht教授。先后在荷兰代尔夫特理工大学/荷兰应用科学研究院(TNO)、法国农业环境工程研究院(CEMAGREF)、香港理工大学/香港科技大学、美国奥本(Auburn)大学、日本歧阜(Gifu)大学等大学和研究机构从事长/短期合作研究7年。

  MarkvanLoosdrecht(马克·梵·洛斯德莱特),1959年7月生于荷兰,瓦格宁根大学环境生物技术博士,荷兰代尔夫特理工大学(TUDelft)教授,荷兰皇家科学与艺术学院(KNAW)院士。

  刘然彬,爱尔兰都柏林大学环境工程专业博士毕业,现为北京建筑大学环境与能源工程学院市政工程系副教授/中-荷未来污水处理技术研发中心成员,专业方向为污水生物处理工艺优化。

  江瀚,清华大学博士。曾任黑龙江七台河矿务局铁东选煤厂生产科技术员;北京首创股份有限公司运营管理部副总经理;徐州首创水务有限责任公司总经理;北京首创股份有限公司办公室主任。现任首创股份有限公司副总经理。


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